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Verdampfungs-Lichtstreudetektion in der HPLC
Als Lichtquelle kann entweder ein Laser oder eine Wolframfadenlampe verwendet werden. Der Weg zwischen Verdampfer und Detektionskammer ist dahingehend optimiert, dass zwar die Eluenten vollständig verdampft werden, aber jede unnötige Wegstrecke vermieden wird. Ein sowohl zu kurzer als auch zu langer Weg zwischen Verdampfung und Detektion würden das Grundrauschen erhöhen und damit die Empfindlichkeit der Anordnung erheblich mindern. Das von den Mikrotropfen gestreute Licht trifft auf den Photomultiplier, das Signal wird verstärkt und einer entsprechenden Auswerteeinrichtung zugeführt. Bei der Elution eines Peaks ändert sich nicht die Anzahl, sondern die Größe der Mikrotropfen. Da die Intensität des gestreuten Lichtes weitgehend eine Funktion der Tropfengröße ist, liefert dieses Signal die Messgröße für die Probenmenge. Zusätzlich geht noch der Brechungsindex und der Absorptionskoeffizient der Tropfen in die Funktion ein, so dass sich von Probe zu Probe unterschiedliche Responsfaktoren ergeben.
Gradientenbetrieb
Da nur die Probentropfen über die Lichtstreuung erfasst werden, kann der Lichtstreudetektor problemlos im Gradientenbetrieb gefahren werden. Voraussetzung ist, dass das Laufmittelgemisch vollständig verdampfbar ist. Mischungen aus Methanol, Acetonitril, Aceton, Chloroform, Hexan und anderen niedrigsiedenden Kohlenwasserstoffen sind völlig unproblematisch. Für Gemische, die Wasser enthalten, muss im Verdampfer ein Temperaturprogramm gefahren werden, da bei einem Gradienten von 0 auf 100% sonst entweder die Temperatur für den Wasseranteil zu niedrig oder für den organischen Anteil zu hoch ist.
Grundlagen
Etwa 80% aller in der HPLC eingesetzten Detektoren benutzen die UV-Absorption zur Erzeugung eines Signals, das der in der Messzelle befindlichen Substanzmenge proportional ist. In den Anfängen war es noch eine Quecksilberdampflampe, die zur Erzeugung ultravioletten Lichts benutzt wurde. Aus dieser Zeit stammt auch noch die in vielen Applikationen vorgeschriebene Wellenlänge von 254,1 nm zur Detektion, das ist einfach die Hauptemissionlinie dieser Lampenart. Die heute fast ausschließlich benutzten Deuteriumlampen emittieren im Bereich von etwa 195 bis 380 nm ultraviolettes Licht, damit erschließt sich schon ein wesentlich größerer Bereich für die Moleküle, deren Absorption gemessen werden soll. Ringstrukturen wie Aromaten haben eine außerordentlich gute UV-Absorption, andere Moleküle wie Kohlenhydrate und Triglyceride sind dagegen praktisch nicht zu erfassen. Da nicht nur die Probe in der Messzelle eine UV-Absorption hervorruft, sondern auch das Laufmittel selbst, ist man hier auf möglichst "durchsichtige" Eluenten angewiesen. Die Darstellung von hochreinen, auch im unteren UV-Bereich nicht absorbierenden Laufmitteln ist aufwendig und teuer, entsprechend steigen die Betriebskosten des HPLC-Systems.
Ideal wäre ein Detektor, der das Vorhandensein eines Laufmittel völlig ignoriert und nur die Probenmoleküle erfasst. Letztere sollten unabhängig von ihrer Struktur ein gutes Signal ergeben, möglichst linear über einen weiten Bereich. Mit dem Lichtstreudetektor käme man diesem universell anwendbaren Gerät schon recht nahe: Das Laufmittel wird nicht detektiert, kann also optimal auf die Trenneigenschaften hin ausgewählt werden. Bei der Gradientenelution sind sehr steile Gradienten möglich, was sich in kurzen Analysenzeiten auswirkt. Auch sehr stark UV-absorbierende Laufmittel können eingesetzt werden. Es wird ausschließlich die Masse detektiert, unterschiedliche Absorptionsmaxima der Probenbestandteile können ignoriert werden.
Anwendungsbeispiele
Für die Lebensmittelindustrie ist die Analytik von Fettsäuren von grundlegender Bedeutung. Die Zusammensetzung der angelieferten Rohstoffe - Öle und Fette - wird durch die enthaltenen Triglyceride charakterisiert. Eine schnelle und zuverlässige Analytik ist wünschenswert, um angelieferte Ware möglichst umgehend zu überprüfen. Neben der Herkunft gibt die Analyse der Triglyceride auch Auskunft über mögliche Verfälschungen und den Frischezustand der Rohware, leistet also einen entscheidenden Beitrag für die Qualitätssicherung.
Bislang wird diese Analytik überwiegend auf gaschromatografischem Wege durchgeführt, vor der eigentlichen Analyse muss eine Umesterung vorgenommen werden, um die gesuchten Substanzen in eine flüchtige Form und damit der GC zugänglich zu machen.Die Hochdruckflüssigkeitschromatografie bietet verschiedene Applikationen an, die aber von der Detektionsmethode und der damit erreichbaren Empfindlichkeit unbefriedigend sind. Dabei wäre die HPLC eine einfache und schnelle Untersuchungsmethode, da keine Umesterung erforderlich ist.
Mit der Lichtstreuung bestehen ausgezeichnete Möglichkeiten für die Analytik von Triglyceriden und anderen Substanzen.